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文 | 林轻吟

编辑 | 林轻吟

●—≺ 摘要 ≻—●

利用七氯对斑马鱼多巴胺神经元的影响，建立斑马鱼帕金森病(PD)模型｡

将斑马鱼鱼卵分为正常对照组(不予干预)，750moL6-轻基多巴胺(6-0HDA)组和不同浓度七氯组(1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000mg/mL、10000ng/mL)。

分别恒温孵育，每24h观察胚胎发育情况并记录直到受精后120hpfhpostfertilization，hpf)，在120hpf做行为学测定，然后实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定多巴胺通路酪氨酸轻化酶(TH2)的相对表达量｡

100010000ng/mL七氯组出现色素沉着分布和脊柱弯曲，而且运动距离更短(P<0.05)、TH2基因表达更低(P<0.05)，变化具有浓度依赖性。

与6-0HDA组比较，七氯组运动距离更短，TH2基因表达更低其中10000g/mL运动离缩短和TH2基因表达降低有统计学差异(P<0.05)｡

●—≺ 试验与方法 ≻—●

帕金森病(parkinson’sdisease，PD)是目前仅次于阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease，AD)的第二大神经系统退行性疾病。

其病理改变多见为黑质部位多巴胺(DA)神经元缺失并伴有进行性震颤、动作延缓、肌肉僵硬和步态异常等表现。

目前，PD运动功能障碍与纹状体内DA神经元数量的减少有着紧密的关系｡

有报道，七氯(CioH，CL，heptachlor)是一种有机氯化合物，具有较强毒性，近年来也被人们广泛用于农作物地下害虫的防治｡

但因其高度的亲脂性可富集在动物体内脂肪中，特别是鱼类和软体动物体内多见，且含量达到其生存水体中七氯含量的200~37000倍｡

长期使用可能会导致人脑黑质中DA神经元的损害，故被认为一直与PD的病理机制有关，本实验将首次尝试用七氯制备PD模型，以期为PD的病因和发病机制的研究提供依据｡

将雌雄斑马鱼分别饲养在标准温度28C、光照14h、黑暗10h的环境下，并于每天上午9点和下午5点喂食2次盐水虾｡

本次动物实验研究属于低等动物，是在充分的动物护理和使用指南下进行的符合国家实验动物管理条例｡

先将胚胎用胚培养水清洗3次，然后收集到干净且无菌的培养皿中，同时利用解剖显微镜挑选优质胚胎。

选出发育正常至囊胚期的胚胎，每孔30枚，放于6孔板中，然后随机分为正常对照组、750umol/L6-OHDA组和七氯组关于七氯杀虫剂对人体的有害剂量｡

在0.08~1mg/L剂量范围对药物浓度最佳剂量进行探索，培养体系为4mL，设置5个浓度梯度即每孔分别为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL1000ng/mL、10000ng/mL七氯组，每孔设计3个复孔取均值｡

每天给药1次，统计并丢弃死卵，连续5d，将给药后的胚胎放于28C恒温光控培养箱中进行培养，连续曝光120h｡

斑马鱼发育情况可以通过是否畸形和形体异常来体现，先镜下观察幼体心脏有无跳动和形体是否发黑，若心脏停止跳动和形体已发黑，则确认死亡｡

每24h记录不同浓度下斑马鱼胚胎死亡和畸形的数目，计算幼体累积死亡率(24~120hpf)和畸形率(24~120hpf)｡

每组随机选取10条鱼，用浓度为40mg/L三卡因将幼虫麻醉，后加入纤维素固形，然后镜下观察并拍摄形体异常改变｡

收集各组120h后的幼鱼，进行触尾实验，先在胚培养水中清洗3次，然后在常规白色泡沫盒中装少许胚培养水｡

每组随机选取1条幼鱼置于胚培养水中，让斑马鱼适应23min后，将针插在幼鱼尾部停留的位置。

随后用另一根针刺激幼鱼的尾部进行行为追踪，直到幼鱼停止游动后，立即将针插在尾部，进行3次重复｡

从-80°C冰箱中取出120hpf下的幼鱼，按照组织总分离试剂盒说明书提取样品总RNA｡

将各组RNA样品逆转录为CDNA，反应设置：第一步50℃，15min，第二步85℃，2min｡

每个样品设计3个复孔，利用公式2-△△CT计算得到实验数据，见表1｡

●—≺ 结果 ≻—●

与正常对照组比较，在24~120hpf时，6-OHDA组死亡率升高(P<0.05)，1~100ng/mL七氯组死亡率差异无统计学意义(P>0.05)，1000~10000ngmL七氯组死亡率升高(P<0.05)。

与6-0HDA组比较，在24~120hpf时，1~1000ng/mL七氯组死亡率降低，但10000ng/mL七氯组死亡率升高(P<0.05)，见图1A。

正常对照组(单体和群体)斑马鱼器官发育正常且体长清晰可见，与正常对照组比较，在24~48hpf时，6-OHDA组和1~10000ng/mL七氯组幼体均无明显变化。

在72~120hpf时，6-OHDA组幼体出现色素分布不均匀和脊柱弯曲，1~100ng/mL七氯组幼体无明显变化，1000~10000ng/mL七氯组幼体出现色素沉着分布和脊柱弯曲。

10000ng/mL七氯组幼体还出现心包水肿、边界模糊、体长缩短、脊柱重度弯曲畸形，甚至造成死亡，见图2A、图2B｡

与6-0HDA组比较，1~100ng/mL七氯组运动距离无明显变化，1000~10000ng/mL七氯组运动距离更短，其中10000ng/mL七氯组运动距离缩短，见图3A｡

与6-OHDA组比较，1000-10000ng/mL七氯组TH2基因表达更低，10000ng/mL七氯组TH2基因表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3B｡

●—≺ 讨论 ≻—●

近年来，6-OHDA药物作为PD的传统模型已被广泛应用，但该模型缺点是不能穿过血脑屏障。

故而选择合适的注射部位是此模型成功的关键｡目前，斑马鱼作为一种常用的神经科学模式生物，具有与人类相似的神经发育等特点，且无需解剖便可观察各器官发育情况。

同时斑马鱼中的基因序列与人脑的基因序列相似度极高。

通过从形态学和行为学方面观察比较，发现可以较好地表现出人类PD患者的部分临床症状｡

另外，与传统模型相比，该方法死亡率较低，操作简单便捷，建模周期短，且后期指标检测取材方便等优势，也为未来PD药物的筛选提供了快速而有效的研究手段｡

七氯属于环二烯类杀虫剂，可以促进大鼠脑细胞内DA神经元中a-突触核蛋白过度表达从而形成胞内包涵体呵｡

研究表明，接触七氯几小时后，体内大约20%的七氯就会降解为环氧化七氯，这些化合物会对DA系统造成破坏。

同时，毒理学发现，些杀虫剂如氨基甲酸酷、有机氯和有机磷酸酷等类物质，会对神经系统造成严重损害。

即诱导氧化应激、线粒体功能障碍、-突触核蛋白原纤维化、神经元细胞丢失，进而逐渐走向细胞调亡，这些病理改变在一定程度上有助于PD的发生和发展。

Meta分析显示，接触除草剂、有机磷农药等物质也是PD发病的危险因素之一。

他们广泛存在于环境中能够选择性破坏黑质一纹状体通路中的DA受体抑制腺昔三磷酸(ATP)的合成，增加氧化反应的生成，最终引发PD样病变。

本研究尝试用七氯诱导的斑马鱼PD模型，出现了幼体死亡、发育形态畸形、行为动作缓慢和TH2基因表达异常等改变。

说明斑马鱼PD模型建立成功｡随着药物浓度的升高，七氯组不仅抑制了斑马鱼发育能力，让幼虫的病死数量逐渐增加。

而且诱发了体型异常，出现心包肿大、鱼嫖缺损、脊柱亚重畸形、体长缩短等情况，提示七氯可影响斑马鱼的生长发育状态｡

行为学显示，七氯组斑马鱼的运动能力下降，速度减慢，运动距离缩短，产生的神经毒性效应要比6-OHDA组更明显，表明PD斑马鱼的运动障碍｡

TH2参与DA合成，其表达水平与脑内DA含量呈正相关关系，因此将TH2含量的表达作为验证PD模型是否成功的关键。

经七氯造模后，TH2的表达水平下降，提示七氯影响了脑内DA的含量｡

本实验结果与之前研究基因表达趋势相同且相关指标变化符合PD特征，证实了一种新的可替代传统方法的斑马鱼PD模型建立的成功同时，突出了杀虫剂七氯在诱导PD发病中的毒素作用｡

其效果与传统造模试剂6-0HDA类似，认为是一种PD造模的合理方法｡另外，斑马鱼遗传操作方便、周期短、产卵多、易饲养，故取培养时间1周为宜｡

●—≺ 总结 ≻—●

传统PD模型造模药物6-0HDA和1000、10000ng/mL七氯，都可通过影响多巴胺神经元功能成功建立斑马鱼PD模型，其中10000ng/mL七氯的造模效果比6-OHDA更显著｡

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